Американские исследователи создали синтетическую генетическую систему, которая заставляет два ключевых пути клеточного старения дрожжей регулировать друг друга по принципу отрицательной обратной связи.
В результате они активируются попеременно, и ни один из них не получает преобладания, ведущего к скорой смерти клетки. Таким способом удалось продлить жизнь грибов в среднем более чем на 80 процентов, а у некоторых — до 105 процентов. Отчет о работе опубликован в журнале Science.
В эукариотических клетках присутствуют эволюционно высококонсервативные факторы транскрипции и связанные с ними сигнальные пути, влияющие на старение клетки и продолжительность ее жизни. У дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) хорошо охарактеризованы два таких фактора: лизиновая деацетилаза гистонов Sir2 и комплекс гем-активируемого белка (HAP). Sir2 подавляет экспрессию рибосомальной ДНК, поддерживая стабильность этого локуса генома; ее отсутствие приводит к дисфункции ядрышка и нарушению синтеза белков. HAP регулирует биосинтез гема и образование митохондрий, без него постепенно прекращается дыхание клетки.
Используя флуоресцентные метки, микрофлюидную систему и таймлапс-микроскопию, сотрудники Калифорнийского университета в Сан-Диего под руководством Джеффа Хэйсти (Jeff Hasty) и Наня Хао (Nan Hao) выяснили, что репликативное старение и гибель дрожжевых клеток могут происходить по двум сценариям. Либо чрезмерная экспрессия рибосомальной ДНК вызывает увеличение и фрагментацию ядрышка, либо снижение продукции гема приводит к агрегации и дисфункции митохондрий.
Изучение механизмов этого явления показало, что уровни экспрессии Sir2 и компонентов HAP (в частности, Hap4) регулирует общий генетический контур. Он работает так, что эти факторы транскрипции ингибируют синтез друг друга, при этом опосредованно активируя продукцию самих себя. То есть в дрожжевой клетке есть своеобразный тумблер, который включает сигнальные пути либо Sir2, либо HAP и соответствующие им сценарии клеточного старения и смерти.
Авторы работы воспользовались теорией динамических систем и моделированием in silico, чтобы оценить, можно ли вмешаться в работу контура Sir2-HAP, чтобы перепрограммировать траекторию старения и продлить жизнь клетки. В частности, если HAP будет стимулировать экспрессию Sir2, а Sir2 — подавлять экспрессию HAP, получится петля отложенной обратной связи между ними. При правильно подобранных параметрах она приведет к устойчивым колебаниям между соответствующими сигнальными путями и, следовательно, динамическому балансу между ними. Таким образом ни один из сценариев старения не получит преимущества, приближающего смерть клетки.
Исследователи реализовали эту модель, снабдив дрожжи синтетическими генными конструктами. Промотор гена SIR2 заменили на соответствующую последовательность от гена цитохрома CYC1, который активируется HAP. Ген HAP4 совместили с промотором триозофосфатдегидрогеназы TDH3 и встроили его в нетранскрибируемый участок рибосомальной ДНК, экспрессию которого подавляет Sir2. Нативную копию HAP4 при этом удалили.
За модифицированными таким способом клетками также наблюдали с помощью флуоресцентных меток, микрофлюидной системы и таймлапс-микроскопии. В отличие от обычных дрожжей, в них наблюдалась осцилляция между Sir2 и HAP со средним периодом 557 ± 151 минута. Это больше, чем типичное время между делениями клетки (90–120 минут), так что эти колебания не связаны с клеточным циклом. Спектральный анализ изменений активности Sir2 во времени показал четкие пики с периодом в 12 часов, которых у обычных клеток не наблюдалось. Примерно у 35 процентов модифицированных клеток ближе к концу жизни осцилляции угасали или рассинхронизировались, что, вероятно, связано с возрастным снижением активности Sir2. Когда синтетический генетический контур лишали любого из его элементов, устойчивых осцилляций между Sir2 и HAP не возникало, то есть для них необходима слаженная работа всех звеньев обратной связи.
Среднее увеличение продолжительности жизни модифицированных дрожжей составило 82 процента по сравнению с контрольной группой. Среди клеток, которым удавалось сохранять стабильные осцилляции между Sir2 и HAP в процессе старения, этот показатель доходил до 105 процентов, а у тех, которые их утрачивали, — лишь до 45 процентов. Также у модифицированных дрожжей клеточный цикл ускорялся до 70–90 минут и медленнее угасал с возрастом. Изменчивость продолжительности жизни между отдельными клетками у них тоже была меньше, чем в контрольной группе (коэффициент вариации 0,29 против 0,48).
Как пишет в сопутствующей статье Говард Салис (Howard Salis) из Университета штата Пенсильвания, не принимавший участие в работе, авторам удалось показать, что дорогу к пониманию и контролю клеточного старения открывают оценка динамики его сигнальных путей, построение моделей в масштабах всей системы и прикладной математический анализ для поиска точек воздействия.
Автор: Олег Лищук