Новая версия знаменитого редактора CRISPR/Cas работает с ДНК на порядки точнее и притом без ущерба для скорости редактирования.
Генетическим редактором CRISPR/Cas пользуются не только в фундаментальных исследованиях, но и в медицине: так, прошлым летом мы писали, как CRISPR/Cas использовали против наследственной полинейропатии. Как он работает, мы опять же неоднократно рассказывали, и подробнее всего в статье, посвящённой Нобелевской премии по химии 2020 г.: её дали как раз за изобретение этого метода. CRISPR/Cas стал исключительно популярным благодаря простоте, универсальности и точности: с его помощью можно быстро и достаточно точно изменить практически любую значимую последовательность ДНК в любом геноме.
Однако достаточно точно — не значит абсолютно точно. CRISPR/Cas допускает ошибки, то есть изменяет ДНК не только там, где надо, но и там, где не надо, и некоторые исследователи полагают, что как раз в человеческом геноме он может позволить себе особенно много лишнего. Можно изменить сам аппарат CRISPR/Cas, чтобы он стал работать точнее. Но тут за точность приходится расплачиваться скоростью — CRISPR/Cas начинает работать очень медленно. Между тем, скорость в молекулярно-клеточных делах важна: CRISPR/Cas собирается сделать то, что должен, клетка может как-то измениться (поделиться, в конце концов), так что момент для редактирования генома будет упущен.
Сотрудники Техасского университета в Остине предлагают в Nature такую модификацию CRISPR/Cas, которая повышает его точность без ущерба для скорости. Исследователи внимательно изучили структуру молекулярного комплекса редактора, чтобы более детально разобраться в том, почему он ошибается. CRISPR/Cas ищет место для редактирования с помощью маршрутной молекулы РНК, или РНК-гида (её так и называют — gRNA, то есть guide-RNA). Последовательность маршрутной РНК совпадает с последовательностью того места в клеточной ДНК, которое нужно изменить. Маршрутную РНК исследователи вручают белку Cas, который и ищет нужное место в геноме. Ищет он, сравнивая последовательности в РНК, которую тащит с собой и в ДНК. Последовательности должны совпасть на протяжении двадцати генетических букв-нуклеотидов. Однако буквы с восемнадцатой по двадцатую белок сравнивает как бы вполглаза, допуская, что они могут не совпадать.
Исследователи обнаружили в трёхмерной структуре Cas9 (из всех Cas-белков его используют чаще всего) небольшой участок, петлю в несколько аминокислот, из-за которой случаются неточности в работе всего белка. Если маршрутная РНК и ДНК не совпадают в нуклеотидах, между ними не образуется достаточно сильной связи, то есть комплекс между РНК и ДНК остаётся нестабильным, и Cas9 идёт искать нужную последовательность дальше. Но если несовпадения приходятся на нуклеотиды в РНК с восемнадцатого по двадцатый, та самая аминокислотная петля в структуре Cas9 стабилизирует обе нуклеиновые кислоты вместе, так что белку в целом кажется, что совпадение полное и цель найдена.
Если внести в Cas9 определённые мутации, чтобы эта петля перестала делать то, что она делает, точность редактора становится намного выше — вероятность того, что он будет редактировать ДНК в неправильном месте, уменьшается в 4000 раз. При этом работает он с обычной скоростью. Пока что новую версию CRISPR/Cas протестировали просто на молекулах ДНК, но в самое ближайшее время исследователи хотят проверить его в живых клетках.
Автор: Кирилл Стасевич