Ученые из Калифорнийского университета в Беркли выяснили, каким образом в бактериальные CRISPR-системы, необходимые для защиты от инфекций и широко используемые в методах современной генной инженерии, встраиваются новые участки ДНК.
Выяснилось, что для правильного и точного встраивания необходима кооперация интегразной системы Cas1-Cas2 и фактора IHF, причем ДНК при этом изгибается, подобно подкове, и ключевым фактором здесь является правильная геометрия механизма, а не точные нуклеотидные последовательности внутри кассеты CRISPR. Исследование опубликовано в Science.
CRISPR-кассета устроена следующим образом: это участок генома, содержащий серию повторов длинной 20-50 нуклеотидов, разделенных «спейсерами» — участками ДНК, например, вирусными, которые система использует как своего рода справочник при борьбе с инфекциями. Если попавшая в клетку ДНК похожа на то, что лежит в справочнике, специальные белки ее узнают и разрезают — это называют иммунным ответом бактериальной клетки.
Новые спейсеры вставляются в CRISPR с помощью интегразного комплекса, состоящего из 4 белков Cas1 и двух белков Cas2. Комплекс вставляет новый спейсер в начало кассеты, перед первым ее повтором, который следует за АТ-богатой лидерной последовательностью. Место, куда вставляется новый спейсер, должно выбрано правильно, потому что при встраивании ДНК в произвольный участок генома, кроме всего прочего, может произойти нарушение работы бактериальных генов.
Известно, что в CRISPR системах в процесса интеграции спейсеров участвуют лидерная последовательность, первый повтор и, в частности, инвертированный повторный GC-богатый участок внутри него. Фактор связывания IHF (Integration Host Factor), похожий на эукариотические гистоны, связывается с лидерной последовательностью и подключает к процессу Cas1-Cas2 комплекс. Ученые решили исследовать этот механизм, детали которого до сих пор были не ясны.
С помощью методов электронной микроскопии и рентгеноструктурной кристаллографии им удалось получить структуры комплексов интегразы и субстратной (инфекционной) и геномной ДНК на промежуточной и финальной стадиях процесса интеграции.
Выяснилось, что благодаря структуре кассеты (в частности, наличию в ней повторов), IHF может согнуть ее, подобно подкове, открывая при этом доступ интегразе к необходимым ей участкам. IHF связывается для этого с двумя сайтами. При этом непосредственного химического контакта (образования водородных связей) между интегразой и геномной ДНК почти не происходит, исключение составляют только несколько водородных связей в месте, где седьмая α-спираль Cas1 входит в малую бороздку спирали ДНК около лидерной последовательности. Основным фактором процесса интеграции являются, однако, не водородные связи, а именно правильная его геометрия, которая достигается за счет определенного расположения сайтов связывания белков и структуры ДНК самой кассеты. GC-богатый инвертированный повторный участок позволяет изогнуть ДНК, участок в середине первого повтора действует как дверная петля, а IHF держит всю эту конструкцию. Точного распознавания сайтов по нуклеотидам сам интегразный комплекс не осуществляет, что лишний раз подчеркивает неселективную природу траспозазы Cas1, описанную во многих исследованиях.
Оказалось также, что при отсутствии IHF гораздо чаще происходит встраивание субстратной ДНК в произвольные участки бактериального генома. При перенесении участка его связывания на пять нуклеотидов в сторону такого не происходит, но снижается эффективность интеграции. Таким образом, правильное взаимодействие IHF и интегразного комплекса Cas1-Cas2 оказывается ключевым для точного и эффективного встраивания новых спейсеров в кассету CRISPR.
При этом, как уже говорилось выше, интегразному комплексу важна структура объекта, куда он будет встраивать новые последовательности, но не конкретные нуклеотидные последовательности внутри него. Возможно, именно с этой особенностью связано огромное разнообразие CRISPR-кассет в бактериях. Ученые считают, что подобный уникальный механизм интегразного комплекса Cas1-Cas2 можно использовать в качестве «молекулярного записывающего устройства» для баркодирования геномов или для нестандартных локус-специфичных встроек.
А о том, как с помощью системы CRISPR создали помидоры, не нуждающиеся в опылении, можно почитать здесь.
Автор: Анна Казнадзей