Шведские ученые разработали методику, позволяющую выделять из образца ткани отдельные клетки и анализировать в них экспрессию генов. Результаты работы опубликованы в журнале Nature Communications.
Сотрудники Каролинского института использовали комбинацию двух методов: лазерной захватывающей микродиссекции (ЛЗМ, LCM) и полного транскриптомного анализа с помощью технологии секвенирования РНК Smart-seq2. Принцип ЛЗМ заключается в том, что с помощью микроскопа в образце ткани выбирают интересующую клетку, после чего образец накрывают прозрачной пленкой и лазером «приклеивают» к ней интересующую клетку, не разрушая ее. Smart-seq2 позволяет синтезировать на основе матричных РНК (мРНК) единственной клетки полноразмерные комплементарные ДНК (кДНК), которые затем усиливают методом ПЦР и секвенируют.
Сочетание ЛЗМ с анализом транскриптома использовали и ранее, однако такие методики требовали от 200 до 4000 клеток для получения достаточного количества РНК для анализа. Однако в ряде случаев необходимо оценить разницу в экспрессии генов между отдельными схожими клетками в небольшом образце ткани. Применение Smart-seq2 и нескольких усовершенствований комбинированной методики позволило ученым с достаточной точностью оценить транскриптом единичных клеток.
В ходе работы исследователи приготовили 12-микрометровые срезы ткани спинного мозга новорожденных мышат и визуализировали в них двигательные нейроны специальным красителем. При этом они успешно использовали не стандартный дорогостоящий набор реактивов, а фиксировали клетки обычным обезвоженным этанолом. Выделенные с помощью ЛЗМ отдельные клетки подвергали прямому лизису гипотоническим раствором и без экстракции и очистки РНК, необходимых для стандартных методик секвенирования, проводили Smart-seq2.
Эксперимент начали со 120 нейронов, постепенно снижая их количество до 50, 30, 10, 5, 2 и 1 клетки. Выяснилось, что выход кДНК при использовании прямого лизиса 50, 30 и 10 клеток сопоставим с результатами экстракции РНК и даже позволяет выделить из единицы образца в среднем больше генов (по мнению исследователей, это происходит из-за потери части генетического материала в ходе очистки РНК). Более того, новая методика, названная LCM-seq, обеспечила уровень успешного полнотранскриптомного анализа в 62 процента для одной клетки, 81 процент для двух клеток и 100 процентов для образцов, содержащих пять и более клеток.
Эффективность LCM-seq подтвердили, выявив с ее помощью разницу в экспрессии генов у близких по структуре и функциям двигательных нейронов из разных участков спинного мозга мыши. После этого, используя методику, ученые успешно определили разницу транскриптомов схожих мотонейронов из посмертных образцов спинного мозга больных боковым амиотрофическим склерозом, а также черной субстанции и вентральной покрышечной области головного мозга пациентов с болезнью Паркинсона.
Таким образом, LCM-seq подходит для анализа экспрессии генов в отдельных клетках даже в крайне малых или частично разложившихся образцах тканей, пишут исследователи. Один из них, Цяолинь Дэн (Qiaolin Deng), отметил, что она проще, дешевле и обладает гораздо большей чувствительностью и воспроизводимостью, чем существующие методики. По мнению ученых, их разработка может найти широкое применение в различных областях биологии и медицины, в том числе в изучении развития рака и идентификации его биомаркеров.
Автор: Олег Лищук