Для множества генов можно узнать, в какой области органа или отдельной клетки нужны белки, которые в этих генах закодированы.
Мы часто говорим об активности генов: где-то какой-то ген очень активен, другой не очень активен, а третий вообще молчит, то есть не работает. Но что значит активность? Как её оценивают? Мы знаем, что генетическая информация записана в ДНК, но чтобы она начала работать, она должна пройти через несколько этапов перевода.
Начинается всё с транскрипции – в клеточном ядре информация копируется из ДНК в молекулы РНК. Потом РНК перемонтируется, из неё выпадают одни куски, а другие заново соединяются друг с другом – происходит то, что называется сплайсинг. Потом РНК отправляется в цитоплазму клетки. Если это матричная РНК, то есть та, которая несёт в себе информацию о белке, она становится шаблоном для трансляции: большие молекулярные машины рибосомы с целым отрядом молекулярных помощников читают (транслируют) матричную РНК и синтезируют полипептидную цепь в соответствии с прочитанным генетическим текстом. Кроме матричных, есть и другие РНК, которые не несут белковой информации и работают сами по себе – они просто отправляются в ту область клетки, где у них есть работа.
На активных генах синтезируется больше РНК – значит, сравнивая РНК с разных генов в разных тканях, мы можем определить, где какой ген более активен. Более того, то же самое можно проделать с отдельной клеткой. Например, у нейрона есть тело и отростки – аксон и дендриты, которые формируют синапсы с другими нейронами. Разные зоны нервной клетки нуждаются в разных белках. С помощью специальных методов, о которых мы уже как-то рассказывали, можно определить, где в клетке скопилась РНК того или иного гена.
Если вкратце, то происходит следующее: в клетку запускают искусственно синтезированную небольшую ДНК; последовательность этой ДНК такова, что она прилипает к РНК нужного гена. Затем именно в той зоне клетки, где к РНК прилипла «поисковая» ДНК, её множество раз копируют (амплифицируют). В крошечном объёме прямо внутри клетки становится много небольших ДНК – настолько много, что их можно просеквенировать, то есть прочесть. И вот к этим ДНК можно добавить новые реагенты для реакции секвенирования. Реакцию организуют так, чтобы там, где идёт чтение ДНК, появлялись флуоресцентные метки. По этим меткам можно понять, какая именно ДНК читается в конкретной зоне клетки. Всё происходит там, где была интересующая нас РНК. Так мы узнаем не только то, активен ли конкретный ген в клетке вообще, но и в каком месте внутри клетки нужен тот белок, который он кодирует.
Однако на самом деле активность гена, как мы её видим по уровню РНК, не всегда соответствует тому, сколько в клетке насинтезировалось белка. Разные молекулы РНК могут довольно долго существовать в цитоплазме, их много раз читают рибосомы, и тогда получается, что при относительно небольшом количестве самой РНК клетка получит много белка. А бывают РНК, которые быстро распадаются, и даже ради небольшого количества белка нужно насинтезировать много РНК-шаблонов. Вообще, у клеток есть целая система регуляции трансляции, так что при одном и том же уровне одной и той же РНК может получаться то много белка, то мало. То есть если мы хотим получить наиболее полную картину активности гена, нужно не только оценить, сколько РНК на нём синтезировалась, но заодно посмотреть, насколько сама эта РНК активна.
Активная РНК – та, на которой идет синтез белка, то есть та, по которой едут белок-синтезирующие рибосомы. То есть нужно найти способ отличить РНК без рибосом от РНК с рибосомами – отличить прямо в клетке, не разрушая её, не превращая ткань в органический суп. Один из способов, как это можно сделать, предлагают в Science сотрудники Броудовского института и Массачусетского технологического института. В состав рибосом входит особая рибосомная РНК (точнее, рибосомных РНК там несколько, но сейчас такие детали не важны). Исследователи использовали «поисковую» ДНК, которая одновременно должна была схватить и матричную РНК, и рибосомную РНК. Если рядом с ДНК-пробой была только рибосома или только матричная РНК, она проходила мимо них. И множество копий можно было синтезировать только для той «поисковой» ДНК, которая схватилась сразу за матричную РНК и рибосому на ней.
Дальше всё продолжалось, как описано выше: для ДНК, которая села на активные молекулы РНК, прямо на месте делали много копий, чтобы можно было прочитать последовательность ДНК-пробы. Тут ещё нужно уточнить, что в образец ткани или к отдельной клетке добавляли разные «поисковые» ДНК – они хватались за РНК от разных генов, и по последовательности амплифицированных ДНК-проб можно было увидеть, где какая РНК активна. Иначе говоря, цель была в том, чтобы определить места, где в клетке или в ткани производится тот или иной белок, и насколько активно он там производится.
Потребность в разных белках меняется в зависимости от фазы клеточного цикла, то есть, иными словами, от жизненного этапа клетки. На примере лабораторных раковых клеток человека исследователям удалось проследить активность почти тысячи генов – ещё раз уточним, что под активностью здесь имеется в виду «полная активность», то есть не только количество РНК, но и то, насколько разные РНК вовлечены в белковый синтез. Конечно, следовало ожидать, что активность генов будет меняться в разных участках клеток и в разное время жизни. Но тут задача была в том, чтобы показать, что у метода достаточная разрешающая способность, что для тысячи генов можно измерить ту самую «полную активность» (хотя многие гены, очевидно, работают вместе и активности их весьма схожи).
Посмотреть сразу такое большое число генов в одной-единственной клетке нельзя, так что результат получился при совмещении данных от множества клеток. Но если взять целый орган, то тут можно рассмотреть активность и тысячи генов, и двух, и больше. В мозге мыши исследователи сумели оценить работу 5413 генов. Причём во многих случаях можно было достаточно ясно различить активность того или иного гена в пределах одного нейрона – синтезируется ли конкретный белок в аксоне или дендрите, в зоне синапса или вне зоны синапса и т. д. Для многих генов оказалось, что высокий уровень РНК в какой-то зоне мозга не соответствует её активности в смысле синтеза белка, и такие вещи, очевидно, следует учитывать, когда речь идёт о молекулярном сопровождении нейрохимических процессов.
Естественно, метод подходит не только к мозгу и не только к раковым клеткам, растущим в лабораторных культурах. Мы много раз писали о том, что в биологии сейчас настала эпоха молекулярно-клеточных масштабных атласов. Клетки в пределах отдельной опухоли, или органа, или даже целого организма переписывают едва ли не поштучно в соответствии с их молекулярным портретом, активностью генов и т. д. Польза подобных атласов в том, что мы начинаем видеть детали, которые раньше просто ускользали от нашего взгляда. Описанный метод – один из тех, которые добавляют новых, но отнюдь не лишних подробностей нашему знанию о самих себе.
Автор: Кирилл Стасевич