Американские исследователи воспользовались технологией CRISPR-Cas и вывели племенных свиней, устойчивых к репродуктивно-респираторному синдрому — вирусной инфекции, наносящей серьезный ущерб сельскому хозяйству.
Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС, «синее ухо», эпизоотический поздний аборт свиней) — высококонтагиозная зоонозная инфекция, вызываемая РНК-содержащими бетаартеривирусами PRRSV 1 и 2 типов. Она проявляется абортами в конце супоросности, рождением нежизнеспособных или маложизнеспособных поросят и сопровождается поражением дыхательной системы. Характерным симптомом служит синюшность ушей, пятачка, хвоста, вульвы и молочных желез — отсюда неформальное название болезни. Инфекция распространена по всему миру; ежегодно она приносит ущерб в миллиарды долларов. Для ее профилактики существуют вакцины, однако их эффективность и доступность ограничены.
Рецептором для вируса в организме хозяина служит острофазный белок CD163, экспрессируемый клетками моноцитарно-макрофагального ряда. В частности, возбудитель взаимодействует с его пятым SRCR-доменом, который кодируется единственным геном в экзоне 7. Предыдущие исследования подтвердили концепцию того, что комплексы Cas9 с двойной гидовой РНК, нацеленной на расположенные до и после экзона 7 интроны, могут удалить домен 5 SRCR, и свиньи после такого вмешательства в эксперименте приобретали невосприимчивость к PRRSV. Однако для коммерческого применения подобного подхода необходимо большее: чтобы аллель устойчивости сохранялась в последующих линиях скрещивания, причем с достаточным разнообразием и без ущерба для здоровья и производительности животных.
Для достижения этих целей Марк Сиган (Mark Cigan) из компании Genus plc с коллегами из разных научных центров США использовали CRISPR-Cas с двойной гидовой РНК для выключения экзона 7 в зиготах свиней трех наиболее распространенных коммерческих пород (крупной белой, ландрас и дюрок), а также искусственно выведенной (с использованием пород пьетрен, крупная белая, гемпширская и дюрок) смешанной линии. Полученные эмбрионы доращивали до стадии четырех клеток и переносили для вынашивания молодым (до первого опороса) племенным свиньям. Их потомство проанализировали на предмет желаемой аллели с делецией (CD163ΔE7), нецелевых мутаций и общей структурной целостности ДНК. Животные с оптимальными характеристиками стали первым поколением (E0) отредактированных линий.
Хряков всех четырех линий E0 использовали для оплодотворения элитных неотредактированных свиней соответствующих пород (по 20–25 на каждого, приносящих по 10–20 поросят), чтобы получить обильное гетерозиготное поколение E1. Частота передачи CD163ΔE7 от 24 хряков E0 потомству составила от 5 до 100 процентов. Животных поколения E1 с желаемой делецией, без нецелевых мутаций и генетического мозаицизма подвергли дальнейшему скрещиванию для получения поколения E2 с закрепившейся аллелью CD163ΔE7. Гомозиготные CD163ΔE7/ΔE7 свиньи этого поколения оказались здоровы, по внешнему виду и поведению не отличались от обычных животных соответствующих линий. Иммуноблоттинг подтвердил, что их белок CD163 имеет меньшую молекулярную массу, то есть отредактирован. Полногеномное секвенирование показало, что внесенные изменения не сопряжены с повышением частоты мутаций de novo.
Устойчивость к PRRSV-1 и PRRSV-2 проверили in vitro в культурах изолированных у животных моноцитов/макрофагов и in vivo на трехнедельных поросятах (их заражали интраназально и внутримышечно, после чего содержали вместе с редактированными и нередактированными животными для свободной передачи вируса). Никаких признаков заболевания и вирусоносительства у гомозиготных CD163ΔE7/ΔE7 животных обнаружено не было.
Примененный подход позволил получить исходную племенную популяцию здоровых и устойчивых к РРСС животных, которую планируется использовать для дальнейшего тестирования на предмет заболеваний и фенотипических характеристик, а также разведения и (после одобрения регуляторными органами) коммерческого распространения. Кроме того, проверенные в ходе исследования инструменты и методики могут служить моделью для получения других аллелей устойчивости к заболеваниям с помощью CRISPR-Cas, отмечают авторы работы.
Отчет о работе опубликован в The CRISPR Journal.
Автор: Олег Лищук