Система для подавления активности генов, основанная на белке Cas13 и направляющей РНК, работает до 80 процентов эффективнее при химической модификации нуклеотидов РНК, рассказывают американские ученые в исследовании, опубликованном в журнале Cell.
Увеличение эффективности и срока жизни молекулы в клетке показали метилирование, внесение серы или инвертированного тимидина в 3’-конец направляющей РНК. Модифицированные РНК также проверили на участке гена SARS-CoV-2 и внутри первичных T-лимфоцитов человека, где они тоже показали свою эффективность.
Система геномного редактирования CRISPR/Cas за короткое время стала неотъемлемой частью многих биологических и медицинских исследований (подробнее о ней мы писали в материале «Запомните эти буквы»). Исследовательницы Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Дудна в 2020 году даже получили Нобелевскую премию за открытие этого механизма в иммунной системе бактерий. Главное преимущество СRISPR/Cas состоит в том, что система позволяет вносить разрыв в заданный участок генома и в дальнейшем включать в него новые последовательности или нокаутировать старые. Такой механизм возможен благодаря двум компонентам системы: короткой направляющей РНК, которая «ведет» систему к определенному району ДНК клетки, и белку Cas9, который вносит в район разрыв.
Но направленные разрывы в ДНК — не единственная цель генных инженеров. Зачастую ученым нужно не просто навсегда нарушить последовательность гена разрывом, но лишь временно подавить его работу. Для этого на базе системы СRISPR/Cas создают системы, способные обнаруживать и подавлять специфические молекулы мРНК — продукты работы генов. Так, другой белок бактериального иммунитета — Cas13 — способен вносить целевые разрывы в мРНК, способствуя ее деградации. В разработке системы на основе одной из форм Cas13 — С2с2 — приняли участие российские биологи под руководством Константина Северинова, который рассказал об этом открытии в интервью.
Однако пока такая система «выключения» генов может работать лишь недолгое время. Все дело в том, что направляющая РНК CRISPR/Cas13 со временем деградирует под воздействием клеточной системы защиты от свободных нуклеиновых кислот. Ферменты нуклеазы расщепляют такие молекулы, чтобы защититься от вирусов или других патогенов.
Ученые из геномного центра Нью-Йорка под руководством Алехандро Мендес-Мансилла (Alejandro Mendez-Mancilla) попытались стабилизировать направляющую РНК системы CRISPR/Cas13. Для этого они использовали четыре типа химических модификаций ее нуклеотидов: внесение серы, метила или обеих групп в три урацила на конце РНК, а также добавление в конец инвертированного тимидина. Все из использованных модификаций уже показали свою эффективность в стабилизации РНК в клетке.
Модифицированные последовательности проверили на генах поверхностных рецепторов клеток: CD46, CD55, CD71. Направляющую РНК внесли в ядро линии трансгенных человеческих клеток, которые экспрессировали Cas13d. Через три дня в клетках проверили уровень мРНК генов рецепторов при помощи проточной цитометрии. Для обычной немодифицированной мРНК эффект почти не был заметен — в клетках было все также много мРНК рецепторов. А вот каждая из модификаций показала повышение эффективности подавления генов (p < 0,0001). Лучше всех работала направляющая РНК с метилированными урацилами — она позволила удалить до 80 процентов мРНК CD71. Однако эффект этой модификации был не так стабилен от гена к гену. Более стабильным оказалось добавление инвертированного тимидина — около 55 процентов для всех генов.
Биологи также попробовали модифицировать и другие нуклеотиды в направляющей РНК, но это не дало никаких результатов, по-видимому, нарушая взаимодействие комплекса с мРНК. Однако тестирование других модификаций нуклеотидов показало, что эффективно также и внесение нуклеотидов-фосфотиоатов в конец молекулы. Исследователи считают, что модификации нуклеотидов спасают РНК от воздействия экзонуклеаз.
Модифицированные РНК проверили на эффективность в терапевтическом применении — биологи разработали искусственную РНК, основанную на последовательности РНК коронавируса SARS-CoV-2 и попробовали уничтожить ее новым подходом. Направляющая РНК с фосфотиоатами на конце действительно показала снижение количества «вирусной» РНК примерно на 70 процентов.
Другой важной проблемой в работе с CRISPR-системами является доставка белка в клетки, которые не так просто генетически модифицировать и встроить в них ген Cas13 (как клетки в описанных экспериментах). Биологи протестировали модифицированные РНК в сборке комплекса РНК-белок перед помещением в клетки. Сначала биологи подобрали условия (температуру, буфер, количество белка и наличие сигнала ядерной локализации в нем) для эффективной сборки и доставки комплекса. После этого они изолировали первичные T-лимфоциты здоровых доноров для тестирования. Для исследованных CD4+ и CD8+ популяций лимфоцитов наблюдалось снижение экспрессии целевого гена на 60-65 процентов после использования модифицированной направляющей РНК.
На основе CRISPR/Cas9 создают все больше новых генно-инженерных инструментов. Так, например, недавно исследователи придумали, как отредактировать эпигеном — совокупность метильных меток ДНК. Система CRISPRoff тоже способна подавлять активность генов, но делает это при помощи метилирования генов, из-за которого на них реже садятся ферменты транскрипции.
Автор: Анна Муравьева