Новый тест на SARS-CoV-2 на основе системы CRISPR/Cas обещает достоверный результат уже за пять минут. При этом он определяет даже десятки копий вирусной РНК в микролитре образца и дает не только количественный, но и качественный ответ.
Чтобы добиться такого результата, ученые использовали комплект из нескольких направляющих РНК вместо одной, а в качестве детектора сигнала приспособила камеру смартфона. Результаты работы предварительно опубликованы на портале нерецензированных манускриптов medRxiv.
Несмотря на то, что первые тесты на SARS-CoV-2 появились в считанные недели после начала эпидемии, вовремя выявить зараженных людей до сих пор сложно. Проблема в том, что тесты должны быть массовыми и быстрыми, поскольку часть людей, которые могут быть заразны, не имеют симптомов или разовьют их только через несколько дней, а концентрация вируса в их слюне часто уже не отличается от таковой у больных COVID-19.
Самый распространенный способ поймать вирус в мазке мокроты — ПЦР (полимеразная цепная реакция) в реальном времени. Принцип ее работы состоит в том, что набор ферментов копирует каждую молекулу вирусной РНК и помечает ее флуоресцентным красителем — и так происходит до тех пор, пока световой сигнал не станет достаточно сильным, чтобы его распознал прибор.
Метод ПЦР популярен в основном за счет своей чувствительности — он позволяет «увидеть» одну-единственную копию РНК в микролитре образца. Но у него есть свои недостатки: тест занимает от нескольких десятков минут до нескольких часов, что с учетом логистических трудностей превращается по меньшей мере в сутки ожидания результата, за которые бессимптомный носитель успевает распространить инфекцию дальше.
Поэтому возник запрос на более быстрые тесты, которые не обязательно должны быть настолько чувствительными: по данным клинических исследований, при концентрации РНК ниже тысячи копий на микролитр количество вирусных частиц в мазке уже не настолько существенно и не представляет большой опасности. Одним из альтернативных методов, который мог бы позволить ускорить тестирование, стала система CRISPR/Cas (та самая, за которую недавно присудили Нобелевскую премию по химии).
Для поиска SARS-CoV-2 эту систему приспособили еще весной, и работало это примерно так: из мазка пациента быстро экстрагируют РНК и несколько раз копируют целиком. Затем добавляют направляющую РНК, комплементарную к последовательностям вируса. Эта РНК связывается с вирусным геномом и активирует фермент группы Cas, который начинает резать вирусную РНК — а заодно и все молекулы одноцепочечной РНК, с которыми встречается. Если добавить в раствор молекулу РНК, связанную с красителем, то при расщеплении он будет высвобождаться и подавать цветовой сигнал о том, что вирус в пробе обнаружен.
Вся эта процедура занимала около часа — что уже быстрее, чем ПЦР в реальном времени, но еще недостаточно быстро для массовых тестирований, а главное — требует сложного оборудования и реагентов. Поэтому группа ученых из Калифорнийского университета под руководством нобелевского лауреата Дженнифер Дудны (Jennifer Doudna) занялась разработкой еще более быстрого и просто теста на SARS-CoV-2.
Исследователи создали десяток направляющих РНК (все они были комплементарны к разным участкам вирусного генома) и отобрали из них наиболее эффективно работающую пару. Система, в которой направляющих РНК стало две, позволила сразу решить несколько проблем.
Во-первых, каждая копия вирусной РНК запускает работу не одного фермента Cas13а, а сразу нескольких. А это, в свою очередь, позволяет обойтись без предварительного копирования всей РНК в образце — сигнал и так оказывается достаточно сильным. В полной версии новый тест занимает полчаса, но уже по первым пяти минутам наблюдения ученым удалось однозначно определить, какие образцы положительны, а какие отрицательны.
Во-вторых, теперь тест-система работает еще точнее и не реагирует на РНК других вирусов: исследователи проверили ее на нескольких родственных SARS-CoV-2 коронавирусах (в том числе MERS) и не получили сигнала. Чувствительность при этом осталась приемлемой — около сотни вирусных РНК на микролитр. Когда же ученые попробовали добавить в систему третью направляющую РНК, то чувствительность оказалась еще выше — до 31 копии на микролитр.
В-третьих, теперь тест позволяет оценить не только наличие, но и количество вирусной РНК. Поскольку из метода исчез этап копирования РНК, то число копий РНК в образце не меняется, и о нем можно судить по интенсивности сигнала. Исследователи полагают, что такая технология могла бы помочь отслеживать развитие болезни у отдельных пациентов.
Наконец, в качестве детектора ученые использовали камеру смартфона, на основе которой сконструировали лазерный флуоресцентный микроскоп, добавив источник лазерного луча и фильтр. Оказалось, что чувствительности камеры достаточно, чтобы обойтись без громоздких приборов и различать сигналы разной интенсивности с образца.
Новая система пока работает только в лабораторных условиях, однако Дженнифер Дудна рассказала журналу Science, что ее коллеги ищут способ выйти со своим изобретением на рынок. Они полагают, что их метод еще долгое время будет оставаться актуальным: даже если вакцина от коронавируса появится в ближайшие месяцы, пока нет никакой гарантии, что вызванный ей иммунный ответ окажется долгосрочным — а значит, останется потребность в массовом тестировании, чтобы отслеживать локальные вспышки инфекции.
Автор: Полина Лосева