Биологи из Калифорнийского университета исследовали процесс репликации ДНК у кишечной палочки, наблюдая за отдельными ее молекулами.
Выяснилось, что две цепи ДНК достраиваются независимо друг от друга, и этот процесс не взаимосвязан, как считалось раньше — обе полимеразы, работающие с разной эффективностью, действуют практически случайно, то ускоряясь, то останавливаясь, и именно благодаря этому средняя их скорость остается постоянной. Исследование, существенно меняющее представление о механизмах репликации и предлагающее данную стохастическую модель, опубликовано в Cell.
Репликация (удвоение) ДНК происходит следующим образом. Двойная спираль в определенном месте расплетается ферментом хеликазой, после чего формируется «репликационная вилка». Фермент праймаза синтезирует на обеих цепях ДНК короткие РНК-затравки, на которые садятся ДНК-полимеразы и начинают энергозатратный синтез дочерних ДНК-цепей на матрице уже имеющихся цепей. Они подставлют аденины напротив тиминов (и наоборот) и гуанины напротив цитозинов (и наоборот), и таким образом, две получившиеся двойные цепи в точности повторяют исходную двойную. В целом в этом процессе задействован целый комплекс ферментов, обеспечивающих правильное движение репликационной вилки и надлежащую геометрию ДНК-цепей.
На одной из исходных цепей (лидирующей), требуется только одна РНК-затравка, а на второй (отстающей) постоянно требуются новые. Это происходит потому, что ДНК-полимераза умеет двигаться по цепи ДНК только в одном направлении. Цепи ДНК антипараллельны, и полимеразы движутся, таким образом, в разные относительно друг друга стороны. Таким образом, на отстающей цепи новая ДНК синтезируется кусками (они называются фрагменты Оказаки). РНК-вставки удаляются потом специальным ферментом, и другая, менее эффективная ДНК-полимераза заполняет образовавшиеся пробелы.
Ранее считалось, что работа ферментов репликационной вилки — довольно слаженный процесс, где все зависит от действий соседей и каждый выполняет свою функцию с определенной скоростью. При этом было не совсем понятно, почему скорость достраивания обеих цепей, в среднем, одинаковая — ведь на одной цепи синтез идет равномерно, а на другой для построения фрагментов Оказаки полимеразе постоянно требуется открепляться и прикрепляться и взаимодействовать с рядом вспомогательных ферментов.
Ученые исследовали отдельные молекулы ДНК кишечной палочки, прикрепленной внутри проточной камеры так, что замкнутая бактериальная ДНК постоянно находилась в вытянутом виде (как полотно на ветру), и поэтому на нее было удобно смотреть. Процесс репликации контролировался добавлением «топлива» — АТФ, а наблюдать за ним позволяли флуоресцентные красители, которые работали на двойных цепях и оставляли темными одиночные. Наблюдения велись с помощью методов флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF).
Выяснилось, что ДНК-полимеразы работают довольно хаотически. Двигаясь по цепи, они могут резко останавливаться, а потом заново начинать синтез, изменив свою скорость, например, в десять раз. При этом ДНК-полимераза на одной цепи может останавливаться, а на другой продолжать работать. Никакой взаимосвязи между работой полимераз не наблюдалось. Концентрация праймазы, которая раньше считалась потенциальным регулятором процесса репликации, на ход синтеза ДНК не влияла. При этом средняя скорость полимераз по прошествии некоторого времени, действительно, выравнивается. Ученые сравнивают это с движением разных полос на шоссе — сначала ты обгоняешь соседа, потом сосед тебя, но в итоге вы приезжаете к цели одновременно.
Фермент хеликаза, который движется в передней части репликационной вилки и расплетает цепи ДНК, может после остановки полимеразы начать от нее отдаляться. Это могло бы быть опасно, ибо длинные «провисшие» одиночные цепи подвержены разрушению, и сразу активируют сигнал, требующий себя чинить. Однако наблюдения показали, что тут срабатывает некий тормозящий механизм — хеликаза каким-то образом знает, что полимераза остановилась, и замедляется примерно в пять раз, поджидая ее.
Именно стохастический принцип работы полимераз, по-видимому, позволяет поддерживать постоянную среднюю скорость репликации обеих цепей удваивающейся ДНК, и парадокс разницы их эффективности оказывается разрешенным не из-за четких детерминистических схем взаимосвязей белков, а, фактически, благодаря наличию в их работе фактора случайности. Такой взгляд принципиально меняет сложившуюся парадигму, касающуюся репликативных механизмов в живых системах.
А о работе зеркальных полимераз и планах о создании зеркальных клеток можно прочитать здесь.
Автор: Анна Казнадзей