Слишком долгое бодрствование губительно для животных, но почему — учёные не знают. Согласно недавно опубликованной статье, разгадка кроется в неожиданной части тела.
Внутри ряда пробирок в светлой тёплой комнате Гарвардской медицинской школы (Harvard Medical School) сотни дрозофил, несмотря на позднее время, продолжают бодрствовать. Эти плодовые мушки не спят уже несколько дней: постоянные вибрации, сотрясающие их стеклянные домики, не дают им расслабиться, держась за крышки пробирок. А рядом с ними, в их же пробирках, — другие бессонные дрозофилы спокойно шевелятся с упорством тех, кто обречён на вечный день. Этих вынуждает бодрствовать до самой смерти генетический твик — модификация, подстроившая их мозг к активности ряда конкретных нейронов.
Они живут недолго. И те, что бодрствуют только из-за вибраций, и модифицированные,— все они быстро умирают. Модифицированные живут вдвое меньше хорошо отдыхающих контрольных. После нескольких дней бессонницы мушки начинают умирать, и вскоре не остаётся ни одной живой. Пробирки пустеют. Лампы продолжают светить.
Все мы прекрасно знаем: чтобы быть на пике формы, нам нужно регулярно спать. Но длительная бессонница не только выбивает из формы — у неё могут быть гораздо более серьёзные прямые последствия: животные, полностью лишённые сна, погибают. Тем не менее, учёные, к великому своему удивлению, обнаружили, что точно объяснить, почему потеря сна смертельна, очень трудно.
Сон принято рассматривать прежде всего как неврологический феномен, однако анатомические исследования, проводившиеся после смерти лишённых сна существ, свидетельствуют о том, что бессонница вызывает в организме удивительное разнообразие нарушений, выходящих за рамки нервной системы. Дефицит сна у людей и лабораторных животных, если он хронический, со временем вызывает такие проблемы со здоровьем, как болезни сердца, высокое кровяное давление, ожирение и диабет. Но не эти болезни являются главной причиной смерти существ, на 100% лишённых сна в течение нескольких дней или недель.
Чем так важен сон, что бессонница смертельно опасна? Можно ли, разобравшись, в чём тут дело, объяснить, почему, прежде чем взяться за что бы то ни было, следует хорошо выспаться? На эти вопросы доцент Гарвардской медицинской школы Драгана Рогуля (Dragana Rogulja) ищет научные ответы, а тем временем под бледным светом инкубаторов её лаборатории бессонные мушки живут и умирают.
Этой зимой холодным утром я встретилась с Рогулей в её кабинете. Она, склонившись над планшетом, просматривала цифровые данные, необходимые для объяснения некоторых из её выводов, и её лицо, обрамлённое коротко постриженными тёмными волосами, выражало эльфийское упорство. Хотя Рогуля по образованию невролог, изучающий развитие нервной системы, она сомневается в том, что основной эффект депривации сна возникает в головном мозге. «Он может возникать где угодно», — считает она, и для большинства людей место его возникновения может оказаться неожиданным.
У Рогули есть факты, подтверждающие её предположение. В статье, опубликованной в журнале Cell, она и её коллеги привели свидетельства того, что, когда дрозофилы умирают от бессонницы, сдвиги, ведущие к летальному исходу, происходят не в мозге, а в кишечнике. На микрофотографиях тёмно-синие лабиринты тонкого кишечника дрозофил освещены огненно-красным светом, выдающим зловещие скопления молекул, разрушающих ДНК и повреждающих клетки. Эти молекулы появляются вскоре после того, как начинается депривация сна, прежде чем любые другие симптомы; если мушкам снова разрешают спать, красное свечение исчезает. Поразительный факт: стоит дать дрозофилам антиоксиданты, нейтрализующие эти молекулы, — и сон теряет для них всякое значение. В этом случае они живут столько же, сколько и их отдыхающие во сне собратья.
Согласно полученным результатам, одной из наиболее важных функций сна — возможно, лежащей в основе комплекса других функций — является регулирование древнего биохимического процесса окисления, посредством которого включаются и выключаются отдельные электроны молекул, участвующих во всём, что происходит в организме, — от дыхания до метаболизма. Сон, предполагают учёные, не следует изучать только в рамках нейробиологии, ибо его корни глубже — в той биохимии, которая едина для всего царства животных.
Смертельнее, чем голод
Отношение к животным в ходе первых исследований, посвящённых полной депривации сна, вызывает ассоциацию с бесчинствами маньяков. В 1894 году на проходившем в Риме Международном медицинском конгрессе русский биохимик Мария Михайловна Манасеина сделала доклад об экспериментах, проведённых на десяти щенках. Она и её лаборанты 24 часа в сутки вынуждали этих животных бодрствовать и постоянно двигаться; через пять дней не осталось ни одного живого щенка. Согласно докладу Манасеиной, депривация сна убивает гораздо быстрее, чем голод: «Для животных полное отсутствие сна губительнее, чем полное отсутствие пищи».
Вскрытие щенков выявило плохое состояние их тканей, и прежде всего — тканей головного мозга, где в изобилии были представлены кровоизлияния, повреждённые кровеносные сосуды и другие ужасные детали. Манасеина сделала заключение, что сон не является бесполезной привычкой. Он почему-то необходим для здоровья головного мозга.
А потом были эксперименты с собаками, которых непрерывно прогуливали более чем сутки. В 1898 году итальянский исследователь Ламберто Дадди (Lamberto Daddi) опубликовал подробные рисунки головного мозга этих животных, подвергавшихся депривации сна. Учёный отметил явное дегенеративное повреждение изображённого органа, подобное тому, какое наблюдалось у собак в результате действия других стрессоров. Примерно в то же время психиатр Сезар Агостини (Cesar Agostini) экспериментировал с собаками, запертыми в клетки с колокольчиками. Всякий раз, когда животные пытались лечь поспать, колокольчики начинали ужасно звенеть. А в 20-х годах ХХ века японские исследователи заменили клетки с колокольчиками на клетки, утыканные гвоздями.
Общим недостатком всех этих исследований, если оставить за скобками жестокость, было то, что при их проведении отсутствовал эффективный контроль. Собаки умирали, и их ткани выглядели ненормально — но действительно ли причина этого — отсутствие сна? А может, дело в том, что непрерывные прогулки и непрерывная стимуляция сами по себе источники стресса? Отделить эффекты бессонницы от тех, что вызываются необходимостью быть на ногах, пока не умрёшь, казалось, невозможно.
Клетка с вращающимся диском
Учёным потребовались десятилетия, чтобы серьёзно взяться за решение данной проблемы. В 80-х годах ХХ века Аллан Рехтшаффен (Allan Rechtschaffen), исследователь сна из Чикагского университета (University of Chicago), ставший известным благодаря новаторской работе по нарколепсии, начал разрабатывать эксперименты, позволяющие отделить эффекты чрезмерной стимуляции от последствий бессонницы. Он изобрёл клетку для крыс с висящим над водой вращающимся диском. Посередине была перегородка, закреплённая так, чтобы пол под животными мог свободно вращаться, а они оставались разделёнными. В эту установку экспериментаторы помещали пару крыс, одна из которых играла роль контрольной, а другой предстояло лишиться сна. Всякий раз, когда вторая пыталась отдохнуть, диск начинал вращаться, сталкивая обеих крыс в воду.
Хотя обе крысы падали в воду одинаково часто, установка гарантировала контрольной крысе возможность немного подремать, тогда как второй крысе, обречённой на бессонницу, приходилось бодрствовать. В этих условиях контрольные крысы ухитрялись спать примерно на 30% меньше, чем обычно, страдая лишь от лёгкого недосыпания. А другим крысам не повезло: продолжительность их сна составляла менее 9% обычного, т.е. они почти не спали.
Крысы обеих групп в равной степени подвергались беспокоящему воздействию, равное число раз испытывая стресс от падения в воду и необходимости карабкаться, обтекая, из воды на диск. Но только крысы, обречённые на бессонницу, начинали хиреть. Их мех становился грубым и скомканным, а его белый цвет — грязно-жёлтым. На их коже появлялись ранки. Они худели, а потом умирали — в среднем примерно через 15 дней. Рехтшаффен нашёл способ продемонстрировать, что потеря сна сама по себе действительно убивает.
Для аспирантов, проводивших эти эксперименты, дни тянулись долго.
«Лаборатория располагалась в жилом доме, так что вы получали спальню рядом с комнатой для экспериментов с животными, — вспоминает Рут Бенка (Ruth Benca), профессор психиатрии Калифорнийского университета в Ирвайне (University of California, Irvine), несколько лет проработавшая с Рехтшаффеном. — Чтобы лаборантам было удобно круглосуточно наблюдать за ходом проводившегося эксперимента, их спальные комнаты находились рядом с комнатами с их подопытными животными, которых лишали сна».
Согласно полученным результатам, одной из наиболее важных функций сна — возможно, лежащей в основе комплекса других функций — является регулирование древнего биохимического процесса окисления.
Работа была сложной и в других аспектах.
«Это была жесть — заставлять животных участвовать в жестоких экспериментах, и это действовало на психику, — говорит Пол Шоу (Paul Shaw), один из более поздних аспирантов Рехтшаффена, а ныне профессор неврологии Университета Вашингтона (Washington University) в Сент-Луисе. — В течение последних семи дней эксперимента приходилось работать в полубессознательном состоянии».
Когда его крысам оставалось жить день или два, протокол требовал от него дать им поспать и наблюдать за их электроэнцефалограммами (ЭЭГ). Он помнит, что, когда монитор резко ожил, объявив о погружении животных в долгожданный сон, будто гора упала с его плеч. «И по сей день он встаёт перед глазами, — рассказывает Шоу про дисплей с теми данными ЭЭГ. — Я мог бы повесить эту картину в рамке на стене, чтобы каждый раз, взглянув на неё, становиться счастливым».
Но эта работа была ещё и чрезвычайно увлекательной. «Чтобы делать это, вы должны верить в ценный результат. Иначе нельзя», — говорит Шоу. Он прибыл в лабораторию после того, как аспиранты, первыми проводившие эти эксперименты, получили свои научные степени и ушли, но, встречаясь с ними, он слышал их истории, пронизанные необычайным волнением. «Никто не хотел получать докторскую степень», — вспоминает Шоу, потому что «все думали, что завтра откроют функцию сна», останься они в лаборатории.
Странные причины смерти
Открытия, сделанные в ходе экспериментов Рехтшаффена, должны были, наконец-то, дать учёным возможность выяснить, как убивает дефицит сна, а это могло бы привести к более глубокому пониманию того, что делает сон жизненно необходимым. Но данные, полученные при вскрытии животных, в общем, лишь усилили путаницу. Постоянно встречающихся различий между контрольными крысами и теми, что умерли от недосыпания, оказалось очень мало, причина смерти вообще осталась неизвестной. Удалось установить лишь то, что лишённые сна крысы были тощими, а их надпочечники — увеличенными. «Анатомическая причина смерти не выявлена», — сделали вывод исследователи.
Более интересными оказались данные, полученные в ходе наблюдений за поведением лишённых сна крыс. «Животные, [хронически] подвергавшиеся депривации сна в данных тщательно контролируемых условиях, потребляют пищи в два — три раза больше, чем в нормальных условиях, и теряют вес, — отметила бывшая аспирантка Рехтшаффена Кэрол Эверсон (Carol Everson), профессор медицины и нейробиологии Медицинского колледжа штата Висконсин (Medical College of Wisconsin). — Пытаясь выяснить, нет ли каких-либо аномалий, которые можно зафиксировать, мы провели все метаболические исследования, какие можно придумать».
Однако исследователи сна упорно придерживались точки зрения, согласно которой ответы на вопросы об основных функциях сна следует искать в головном мозге. Джон Аллан Хобсон (John Allan Hobson), известный исследователь сна из Гарвардской медицинской школы, даже опубликовал в журнале Nature статью, озаглавленную «Сон — это то, что непосредственно связано с головным мозгом, порождается им и служит ему» (“Sleep is of the brain, by the brain and for the brain”). «Это выражало тогдашний дух всего сообщества исследователей сна», — вспоминает Шоу.
Даже сейчас подавляющее большинство исследований сна в основном посвящено головному мозгу и когнитивным расстройствам. Известно, что у людей потеря сна влияет на метаболизм — существует связь с диабетом и метаболическим синдромом, — но зачастую единственными, кто изучает это, оказываются исследователи из системы общественного здравоохранения. Те, кто стремится выяснить фундаментальную функцию сна, редко интересуются обменом веществ и другими химическими процессами.
Активные формы кислорода
В центре внимания Рогули — нейроны, которые участвуют в регуляции сна. Но факт, что потеря сна нарушает кровообращение, пищеварение, работу иммунной системы и обмен веществ, заставил её задуматься о том, возникают ли эти нарушения под влиянием неврологических проблем или не зависят от них. «По-видимому, дело не только в головном мозге», — считает она.
Она знает об экспериментах Рехтшаффена — «настоящей классике» — и о том, что потом они не получили существенного развития. Как только было установлено, что полная потеря сна убивает, использование депривации сна для изучения его функции отошло на второй план. Однако за прошедшие десятилетия главным модельным организмом в области исследования сна стала дрозофила, так как её генетика хорошо известна и ею легко манипулировать, а ещё потому, что содержание дрозофил в лабораторных условиях обходится недорого. Многие свойства сна, сначала выявленные у плодовых мушек, позднее были обнаружены у млекопитающих. С появлением дрозофил в качестве полезных испытуемых смертельная депривация сна снова стала рассматриваться как перспективная тема научного поиска, и как раз в это время данная тема заинтересовала Рогулю.
Когда в 2016 году в лабораторию Рогули приехала постдок Александра Ваккаро (Alexandra Vaccaro), они вдвоём разработали план нового исследования. Во-первых, из других лабораторий они получили плодовых мушек, генетически модифицированных так, чтобы определённые нейроны имели чувствительные к теплу каналы. Стоило поднять температуру выше 28 градусов по Цельсию, как эти каналы открывались и оставались открытыми, поддерживая активность нейронов и бодрствование мушек. С закрытыми каналами мушки наслаждались нормальным 110-дневным циклом жизни. С открытыми каналами они начинали умирать от полной депривации сна примерно через 10 дней, а через 20 дней в живых не оставалось ни одной.
Тесты, проведённые Ваккаро, дали интригующие результаты. Если на десятый день она закрывала каналы и позволяла мушкам спать, они выздоравливали и жили столько же, сколько контрольные. Но, если через пять или 10 дней она снова лишала их сна, они умирали. Дрозофилы явно не успевали устранить ущерб, нанесённый их здоровью во время их первоначальной бессонницы, и им требовалось 15 дней нормального сна, прежде чем их снова можно было лишать сна, не вызывая немедленной смерти.
Когда Ваккаро вскрывала мушек на разных стадиях депривации сна, их ткани выглядели целыми и невредимыми, за одним бросавшимся в глаза исключением: их кишки были вздувшимися из-за активных форм кислорода (АФК) — молекул с атомом кислорода, имеющих на внешней орбите свободный электрон. Некоторые АФК вырабатываются в ходе нормальных процессов, идущих в организме (дыхания, обмена веществ и иммунной защиты), иногда для осуществления определённых функций, а иногда — как побочные продукты. Но если АФК не обезвреживаются антиоксидантными ферментами, они становятся чрезвычайно опасными, потому что несбалансированный кислород отрывает электроны от ДНК, белков и липидов. И в самом деле: когда у дрозофил после недельной депривации сна появлялись АФК, маркеры окислительного повреждения взлетали, а это — признак критического состояния клеток.
На десятый день депривации сна уровень АФК достигал максимума. Когда мушкам разрешали нормально спать, требовалось около 15 дней, чтобы снизить этот уровень почти до исходного, — именно столько времени, сколько нужно мушкам, чтобы выдержать возобновление депривации.
Рогуля и Ваккаро не ожидали, что такой однозначный результат им удастся получить всего лишь через несколько месяцев после начала реализации их совместного проекта. Всё было таким явным, что породило у них сомнения. Когда Рогуля продемонстрировала предварительные данные на собрании учёных, работавших в рамках биомедицинской программы Исследовательского центра Пью, её доклад вызвал бурное возбуждение, и это слегка встревожило её. «Такого никогда не было», — отметила она и предпочла впредь делать выводы осторожнее.
В результате последние три года Ваккаро и Рогуля вместе с исследователем-постдоком Йосефом Капланом Дором (Yosef Kaplan Dor) потратили на то, чтобы очевидная связь между окислением и потерей сна не вызывала сомнений из-за каких-нибудь нестыковок. Теперь исследователи лишали дрозофил сна более традиционным способом — путём встряхивания пробирки через каждые две секунды — и проверяли, коррелирует ли уровень АФК с уровнем потери сна; корреляция была. Команда наблюдала дрозофил с мутациями, способствующими сну или бодрствованию; в кишечниках дрозофил, лишённых сна, присутствовали АФК. И наоборот: в кишечниках дрозофил-мутантов, легко переносящих отсутствие сна, АФК не наблюдались.
Наверное, самым странным и самым увлекательным периодом реализации проекта был тот, когда исследователи решили так: раз окисление, вызываемое АФК, губительно для дрозофил, то, возможно, им нужно давать антиоксиданты. Сначала эта идея — разработать здоровое питание для мушек — показалась фиглярской шуткой. Однако Ваккаро нашла подходящие антиоксиданты и стала давать их дрозофилам. К удивлению исследователей, у этих мушек, которых из-за депривации сна ждала преждевременная смерть, продолжительность жизни оказалась нормальной. То же самое произошло и тогда, когда учёные повысили уровень антиоксидантных ферментов в кишечнике плодовых мушек (но, что характерно, не тогда, когда они проделали это в нервной системе).
«Не могу представить себе более весёлое научное исследование, — смеялась Рогуля в то лето. — Вся моя семья и вся лаборатория — все мы по утрам, когда начали давать им эти антиоксиданты, толпились с возгласами: «Они живы!» А они не только были живы — они ещё и выглядели отлично».
Ваккаро и техник-лаборант Кейси Намбара (Keishi Nambara) вместе с сотрудниками лаборатории Майкла Гринберга (Michael Greenberg) в Гарварде выполнили урезанную версию эксперимента с дрозофилами на мышах. Они держали мышей без сна до пяти дней в клетке с вращающимся прутом, который мягко толкал животных, вынуждая их двигаться. В мышиных кишечниках появилось характерное свечение, вызываемое АФК.
Проблема, связанная с кишечником
У Шоу последняя статья команды Рогули вызвала большой интерес. «Это здорово, что они воспользовались достижениями генетики, — заявил он. — Мы отказались от реализации целого проекта, в рамках которого предполагалось [механически] лишать дрозофил сна до самой их смерти, потому что это — долгие, тяжёлые эксперименты», и трудно осуществлять контроль за стрессом. Поскольку команда Рогули использовала как генетические, так и механические средства лишения сна, она обошла эту проблему. «Фантастика, фантастика. … Я был восхищён, — сказал Шоу. — Я отметил превосходный контроль».
О чём именно говорят сделанные открытия, ещё предстоит выяснить. По-видимому, они свидетельствуют о том, что сон жизненно важен для регуляции окисления в организме, особенно в кишечнике, и что эта регуляция серьёзно влияет на весь организм. «То, что для предотвращения смерти достаточно одного-единственного средства, похоже, говорит о наличии общей причины постепенного коллапса почти всех основных функций организма», — пишут Рогуля и Ваккаро в своей последней статье. У дрозофил, которых они изучали, это одно-единственное средство — антиоксиданты.
Их результаты согласуются с потоком более ранних сообщений, указывающих на связь между окислением и недосыпанием, — особенно с отчётами Эверсон, которая заинтересовалась метаболизмом, работая в лаборатории Рехтшаффена. Эверсон быстро смекнула, что у сна не только неврологическая база, хоть и регулирует его головной мозг. У крыс, подвергшихся депривации сна, она наблюдала признаки иммунологических нарушений и наличие бактерий в тех тканях, которые должны были оставаться стерильными. Позднее, в 2016 году, она и её коллеги сообщили, что обнаружили в печени, лёгких и тонком кишечнике лишённых сна крыс окисление. Часто после лишения сна, отметила Эверсон, в тканях обильно проявляют себя маркеры воспаления, но их источник до сих пор не установлен. Если где-то в организме возникло неконтролируемое окисление, оно может быть вызвано критическим повреждением клеток.
Кроме того, Эверсон обнаружила, что кишки лишённых сна крыс начинают протекать, выделяя в кровоток животных бактерии. Однако у дрозофил Рогуля и её коллеги такое протекание не зафиксировали. Не отметили они и рост уровня АФК где-либо ещё, кроме кишечника плодовых мушек. И хотя дрозофилы, подвергшиеся депривации сна, иногда ели больше, чем в нормальных условиях, уровень АФК в их кишечниках независимо от этого оставался одним и тем же.
Как все эти кусочки пазла на тему окисления у крыс и дрозофил свести в единую картину, пока неясно. Хотя проведённые эксперименты дают понять, что дрозофил убивают АФК, отмечает исследователь сна из Имперского колледжа Лондона (Imperial College London) Джорджио Джилестро (Giorgio Gilestro), это не обязательно означает, что крыс тоже убивают АФК. Небольшое исследование страдающих бессонницей людей показало изменение после недостаточного сна состава их кишечного микробиома (сообщества живущих в кишечнике бактерий). Это открытие, если получит подтверждение, окажется очень интересным, ибо показана ещё одна связь между сном и кишечником.
Однако самой острой проблемой, возможно, является то, что никто не знает, из-за чего возникает рост уровня АФК и почему они скапливаются в кишечнике. Какой процесс — метаболический или иной — генерирует их? Вызывает ли перепроизводство АФК депривация сна? Или она встревает в какой-то процесс, который обычно устраняет избыточные АФК? И почему АФК так или иначе связаны со сном? Для изучения некоторых аспектов этих вопросов Рогуля планирует провести новые эксперименты.
За всем этим скрывается удивительное, загадочное разнообразие того, что сон делает для организма. Тот факт, что воздействию подвергаются обучение, обмен веществ, память и множество других функций и систем, делает весьма интересной такую кардинальную перестройку организма, как изменение уровня АФК. Но даже если за летальным характером потери сна стоят АФК, у нас нет никаких доказательств того, что, например, у когнитивных эффектов сна этот же источник. И даже притом что антиоксиданты предотвращают преждевременную смерть дрозофил, их действие может не распространяться на другие функции сна, или, если всё же распространяется, причины могут быть разными.
Дрозофилы, которые никогда не спят, и их светящиеся кишки напоминают нам о том, что сон нельзя сводить к функционированию разума и головного мозга, ибо он, в сущности, — переживание всего тела. В гибели плодовых мушек могут скрываться ответы на некоторые вопросы о том, почему бессонница убивает, и о том, — возможно, почти та же тема, — что делает сон, чтобы связать существенно отличающиеся друг от друга системы организма. Что касается Шоу, то ему не терпится узнать, какие ещё результаты будут получены в лаборатории Рогули. «Это архиважная проблема, — считает он, — а они изобрели способ исследовать её».
Автор: Вероник Гринвуд (Veronique Greenwood), Перевод: Александр Горлов