Исследователи из Массачусетского технологического института и Института Броуда при MIT и Гарвардском университете разработали новый способ получения быстрых изображений синаптических белков в высоком разрешении.
Синаптические белки имеют множество функций. Многие из них участвуют в формировании синаптических каркасов, обеспечивающих секрецию нейромедиаторов, а также обработку входящих сигналов. Синапсы содержат сотни таких белков, однако обычная флуоресцентная микроскопия позволяет увидеть не более четырех белков одновременно.
Чтобы снять это ограничение, команда MIT разработала новую технику на основе существующего метода под названием DNA PAINT (его создатель – Ральф Юнгман из Института биохимии общества Макса Планка), который заключается в том, что исследователи маркируют белки или другие представляющие интерес молекулы с помощью зонда ДНК-антитело. Затем они визуализируют маркированный белок при помощи олигонуклеотида (фрагмента ДНК) с флуоресцентной меткой, который связывается с комплементарным фрагментом ДНК на зонде ДНК-антитело и благодаря метке становится видимым через флуоресцентный микроскоп.
Молекулы ДНК имеют низкую степень сродства, поэтому связи между ними постоянно разрываются и образовываются снова. В результате получается мигающая флуоресценция, которую возможно увидеть благодаря микроскопии сверхвысокого разрешения.Тем не менее получение изображения каждого белка занимает около получаса, что делает такой метод непрактичным для отображения большого количества молекул.
Марк Бат (Mark Bathe) и его коллеги усовершенствовали метод, изменив структуру олигонуклеотида с флуоресцентной меткой, чтобы он мог более прочно связываться с комплексом ДНК-антитело. Они использовали так называемые «запертые» нуклеиновые кислоты – РНК с химически модифицированной рибозой, которые более термостабильны. Такая методика дает намного более яркий сигнал, поэтому изображение можно получить быстрее, хотя и с немного более низким разрешением. Новый метод получил название PRISM (Probe-based Imaging for Sequential Multiplexing).
С помощью этой техники исследователям удалось промаркировать и отобразить одновременно 12 различных синаптических белков.
«Эксперимент занимает всего час, тогда как на ту же работу с использованием старого метода уходила целая ночь», — комментирует Бат.
Анализируя тысячи нейронов, исследователи смогли определить группы белков, которые имеют тенденцию связываться друг с другом чаще, чем другие, и сделать выводы, как синапсы различаются по содержащихся в них белкам. Такая информация поможет более полно раскрыть функции синапсов и упростить их классификацию на подтипы.
«Мультиплексная визуализация важна, потому что даже в пределах одного мозга между синапсами и клетками существует огромное множество различий. Возможность одновременно взглянуть на все белки в образце поможет выявить субпопуляции различных синапсов, открыть новые типы синапсов и установить, как генетические вариации влияют на них. Таким образом, мы приблизимся к пониманию механизмов возникновения многих заболеваний», — говорит Марк Бат.
О своем изобретении ученые рассказали на страницах Nature Commutications.
Текст: Диана Галимова