Российские ученые совместно с зарубежными коллегами обнаружили, что яд паука Heriaeus melloteei может стать основой для создания лекарств от гипокалиемического периодического паралича.
Это заболевание вызвано мутацией генов, приводящих к возникновению так называемых токов «утечки» через потенциал-зависимые ионные каналы NaV1.4 в скелетных мышцах. В результате такого дефекта канала мышцы оказываются неспособны отвечать на сигналы нервной системы, и развивается слабость вплоть до паралича. До сих пор надежного лекарства от всех случаев этой болезни не существует. Результаты работы опубликованы в журнале PNAS.
В состав любой клеточной мембраны входят ионные каналы — белковые поры, избирательно пропускающие ионы, а также специальные насосы — помпы, перекачивающие определенные типы ионов внутрь клетки и наружу. За счет их работы мембрана оказывается неодинаково заряжена с двух сторон, то есть обладает разностью потенциалов. В отсутствие раздражающих стимулов потенциал поддерживается на постоянном уровне. Под действием разнообразных сигналов определенные ионные каналы открываются или закрываются, изменяя, таким образом, ток ионов внутрь и наружу клетки, а также заряд мембраны. В результате некоторые клетки (нервные, мышечные и железистые) возбуждаются — получают возможность отвечать на сигнал.
Однако порой гены, кодирующие каналы, оказываются повреждены, и ответ клеток может стать неадекватным. Например, дефекты потенциал-чувствительных доменов потенциал-зависимых натриевых каналов NaV1.4 в мышцах приводят к тому, что даже в закрытом состоянии они пропускают ионы натрия в клетку, меняя разность потенциалов мембраны. Сигналы от нервной системы более не способны возбудить мышцу — развивается паралич. У больных гипокалиемическим периодическим параличом второго типа развивается слабость вплоть до полного обездвиживания. К сожалению, существующие лекарства для облегчения их состояния зачастую неэффективны.
Структурная организация канала NaV1.4 в мембране (A,B) и сравнение последовательности первого потенциал-чувствительного домена (DI) с другими натриевыми и калиевыми каналами (B). Канал состоит из пяти мембранных доменов, четырех потенциал-чувствительных, сформированных спиралями S1-S4 (голубые цилиндры), и одного порового, сформированного спиралями S5-S6 (серые цилиндры). На спиралях S4 находятся воротные положительные заряды (отмечены знаками «+»). Мутации соответствующих остатков приводят к токам «утечки», которые ответственны за возникновение ряда заболеваний (каналопатий), включая гипокалиемический периодический паралич (красные ромбы). В работе исследовали новую мутацию Arg222/Trp домена DI (красный ромб на панели C). Положение сайтов связывания токсинов пауков, влияющих на активацию канала, показано штриховыми рамками. Красная и зеленая – ранее известные сайты, фиолетовая – сайт на домене DI впервые описанный в работе.
«Наша работа посвящена изучению потенциал-зависимых ионных каналов человека, в частности, рассмотрению мутаций NaV1.4 канала из скелетных мышц, отвечающих за развитие тяжелого заболевания — гипокалиемического периодического паралича второго типа. В работе впервые показано, что существуют природные соединения, способные заблокировать токи «утечки» через мутантные каналы», — рассказывает Михаил Петрович Кирпичников, доктор биологических наук, академик РАН, декан биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.
Применяя целый арсенал методов генной и белковой инженерии, электрофизиологии, ЯМР-спектроскопии и компьютерного моделирования, исследователи изучили причины «неправильной» работы поврежденного мутацией канала. В качестве блокатора был впервые предложен токсин из яда паука Heriaeus melloteei, и, согласно результатам, полученным с помощью сайт-направленного мутагенеза, электрофизиологии, ЯМР-спектроскопии и компьютерного моделирования, он фиксирует потенциал-чувствительный домен канала в положении, устраняющем ток «утечки».
«Открытие подобного действия токсина позволяет надеяться, что можно создать эффективные препараты для лечения больных гипокалиемическим параличом и другими сходными недугами. Полученная нами модель взаимодействия канала и токсина из яда паука открывает перспективы для разработки новых лекарств», — заключает Александр Василевский, кандидат химических наук, преподаватель МГУ и заведующий лабораторией в ИБХ РАН.
Структурную часть работы комментирует Захар Шенкарев, доктор физико-математических наук, профессор РАН, преподаватель МФТИ и руководитель группы в ИБХ РАН: «Исследования структур комплексов ионных каналов с токсинами в мембране представляет непростую задачу. Основная проблема в нашей работе была связана с низкой стабильностью образцов в условиях ЯМР-эксперимента. Для ее решения нам пришлось разработать целый ряд новых экспериментальных методик, что позволило ускорить процесс сборки структурных данных с нескольких дней до нескольких часов. В результате нам удалось впервые построить экспериментальную модель комплекса натриевого канала с токсином паука, а также охарактеризовать новый сайт связывания токсинов, который расположен на первом потенциал-чувствительном домене (DI). Ранее были известны сайты связывания, располагающиеся на втором и четвертом доменах (DII и DIV)».
Структура комплекса канала Nav1.4 из мышц человека с токсином Hm-3 из яда паука Heriaeus melloteei по данным ЯМР. (A) Комплекс Hm-3 (голубой/фиолетовый) с первым потенциал-чувствительным доменом (DI) канала (песчаный/красный). Вид сбоку, со стороны липидного бислоя. (В) Комплекс токсин-канал. Вид на плоскость мембраны со стороны внеклеточного пространства.
Работа выполнена сотрудниками ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН совместно с коллегами с биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова и МФТИ, а также зарубежными коллегами из Института неврологии Университетского колледжа Лондона и Школы медицины Университета Джонса Хопкинса в Балтиморе при поддержке Российской академии наук (программа «Молекулярная и клеточная биология») и Российского научного фонда (РНФ).