Биологи из Технологического института в Хайфе и Гарвардской медицинской школы проследили за возникновением и эволюцией устойчивости к антибиотикам среди бактерий, живущих на двумерной среде.
Результаты экспериментов показали, что структура того пространства, где живут микроорганизмы, играет очень важную роль в определении путей их эволюции. И законы этой эволюции сильно отличаются от того, что ученые обычно наблюдают в лабораторных экспериментах в жидкой среде. Работа опубликована в журнале Science.
Проблема возникновения устойчивости к антибиотикам и исчерпания ресурса эффективных антимикробных веществ является одной из самых острых в современной медицине. Например, уже сейчас существуют так называемые «супербактерии» — штаммы бактерий, которые нечувствительны ко всем известным антибиотикам, в т.ч. последнего эшелона (о том, как так вышло, мы уже подробно писали). При этом механизмы формирования устойчивости к антибиотикам изучены на сегодняшний день только фрагментарно.
Например, хорошо известны так называемые гены множественной устойчивости, которые бактерии передают друг другу на портативных ДНК-носителях, плазмидах. Большинство из этих генов кодируют молекулярные помпы, которые умеют выкачивать разнообразные антибиотики из клетки наружу. Относительно хорошо известны и механизмы, которые используют для собственной защиты те бактерии, которые сами вырабатывают антимикробные вещества. Однако устойчивость к антибиотикам может быть связана не только с приобретением «защитных» генов, но и с мутациями в тех генах, которые, на первый взгляд, никакого отношения к антибиотикам не имеют.
Такую спонтанную устойчивость тоже изучают, но, как выясняется, не всегда выводы, сделанные в лабораторных условиях, могут быть применимы в клиническом опыте. Дело в том, что обычно эксперименты по «эволюции-в-пробирке», где ученые пытаются проследить за возникновением устойчивости, проводят в жидкой среде — это позволяет работать с большим количеством бактерий и находить очень редкие мутации. Однако жидкая среда принципиально отличается от большинства естественных мест обитания бактерий. В реальности микроорганизмы обычно формируют сложные сообщества (биопленки) на слизистых оболочках тканей, на поверхности продуктов и т. д. Даже без учета взаимодействий между разными видами в биопленке рост в такой сложно устроенной среде принципиально отличается от роста в жидкости. Прежде всего тем, что там не происходит постоянного перемешивания, а значит и концентрация антибиотиков и правила конкуренции за пищевые ресурсы устроены совсем иначе.
Чтобы приблизится к правильному пониманию возникновения устойчивости к антибиотикам, авторы новой работы воспроизвели эксперимент по «эволюции-в-пробирке» — но не в пробирке, а в двумерной среде. Для этого они создали огромную (по лабораторным меркам) чашку Петри, в которой колонии могли расти, бороться за ресурсы и эволюционировать в течение длительного времени. За тем, как это происходит, ученые наблюдали с помощью таймлапс-съемки, а некоторые отдельные колонии были еще и отсеквенированы на предмет новых мутаций. Чашка была устроена таким образом, что в нижней ее части находились полоски с антибиотиков в разной концентрации, а сверху был залит тонкий слой питательной среды, по которому могли двигаться бактерии.
Градиент антибиотика был ступенчатый, с резким (на порядок) увеличением концентрации вещества от одной полосы к другой. Поэтому, когда бактерий подсаживали в исходную точку, они сначала заполняли полосу чашки без антибиотика, а только потом начинали двигаться туда, где были не только свежие ресурсы, но и антибиотик. Устойчивые бактерии сначала заполняли одну полосу, потом, — если возникала новая мутация, повышающая устойчивость к повышенной концентрации — другую, и двигались так пока не доходили до полосы с максимальной концентрацией.
Заселять новую территорию могли только бактерии, которые приобретали за счет спонтаных мутаций устойчивость. На таймлапс-видео хорошо заметно, как появление таких индивидуальных бактерий приводит к формированию целых «вееров» колонизаторов, которые распространяются по новой территории. Важная особенность эксперимента в двумерной среде заключалась в том, что заселение любого участка территории истощало его ресурсы и делало уже не привлекательным для повторной колонизации другими бактериями. Поэтому на чашке постепенно формировались сложные, почти древовидные структуры, где почти каждая точка была занята только потомками одной клетки. Изучая структуру и генетику такого «дерева колонистов», ученые могли следить за тем, как проходила эволюция бактерий.
Из результатов наблюдения «эволюции-в-пробирке», которые приводят ученые, можно сделать два основных вывода.
Во-первых, эксперимент подтвердил, что для появления устойчивости очень важно наличие антибиотика в промежуточных концентрациях. Когда из всего спектра концентраций ученые оставляли на чашке только нулевой и максимальный, то ни одна бактерия так и не смогла приобрести устойчивость. Если же переход от нуля к максимуму был постепенным (хотя бы через две ступени), то та же самая максимальная концентрация становилась доступна для мутировавших бактерий. Это показывает, насколько важно (в клиническом смысле) соблюдать дозировку и режим приема антибиотика — недостаточность концентрации или времени приема приводит к быстрому формированию устойчивости, к появлению мутантов, с которыми уже нельзя справиться.
Второй вывод заключается в том, что двумерная среда по-другому действует на эволюцию бактерий. Если в жидкой среде преимущество получают те клетки, которые обладают максимальной скоростью роста при данной концентрации вещества, то в на чашках важна не только сама устойчивость, но и скорость ее приобретения. На снимках чашек видно, что часто уже после того, как первые «колонисты» заполняли новую территорию, на ней возникали колонии с более удачными мутациями. Такие колонии росли значительно быстрее тех, что исходно заселяли территорию, и даже могли их подавлять (если тех искусственно перенести на «фронтовую линию»). Однако в большинстве своем удачные мутации возникали слишком поздно, когда основные ресурсы среды уже были израсходованы. Поэтому такие «супер-колонии» оказывались отрезанными от фронта колонизации, развивались в изоляции и не оказывали никакого влияния на развитие всего сообщества, превращаясь, таким образом, в тупиковые вети эволюции.
Автор: Александр Ершов